LightNing® EcoRV內切酶組成

特性和用法

LightNing® EcoRV內切酶，可在5~15 min內完成反應

u建議反應條件

1× CutOne®緩沖液；

37℃溫育；

參照“DNA 快速酶切流程"配制反應體系。

u失活條件

80℃溫育20 min。

u甲基化敏感性

對于被 CpG 對甲基化的 DNA，剪切可能受阻，

對于被 EcoBI 甲基化的 DNA，剪切可能受阻。

u儲運條件

-20℃

相關問答

Q:為什么在CutOne® Buffer中加入HSA？

A:一些酶在反應過程中需要HSA的參與，我們在CutOne® Buffer中添加了HSA，避免反應中額外添加組分，使得酶切反應更加便捷。

Q:HSA的添加對于雷霆系列限制性內切酶的功能會產生什么樣的影響？

A:在我們的測試中未曾發(fā)現(xiàn)HSA對于雷霆系列限制性內切酶的功能有任何影響。在有些情況下，對于部分的酶切反應有促進作用。

Q:我需要嚴格遵守5~15 min的酶切時間嗎？能夠延長反應時間嗎？

A:雷霆系列限制性內切酶經(jīng)過改造可以將酶切時間縮短至5~15 min。同樣也消除了限制性內切酶的星活性（長時間反應造成的非特異性消化），在說明書中告知的星活性出現(xiàn)的時間范圍內可以適當延長反應時間。

Q:我什么時候應當考慮星活性對于酶切反應的影響？

A:如果額外的酶切條帶對于實驗結果會產生影響時我們應當考慮星活性對于酶切反應的影響。例如：進行基因型、突變型分析或克隆時我們應當避免星活性的產生。避免星活性的有效方法：適當擴大反應體積（較小的反應體積容易造成甘油體積達到或超過總反應體積的5%）；不進行超長時間孵育（過夜消化極易產生星活性）。

Q:有哪些關鍵因素會導致星活性？

A:長時間孵育、過量的酶、高甘油含量（通常高于5%）、較小的反應體系等因素都會導致星活性的產生。

Q:未經(jīng)純化的PCR產物直接酶切要怎樣設定體系？

A:反應體系推薦由這些內容組成：10 μl PCR產物、2 μl 10×CutOneTM Buffer、1~2 μl相應的限制性內切酶、ddH2O補齊到30 μl。酶的用量根據(jù)PCR產物的濃度而定，只加入2 μl反應緩沖液的原因是PCR反應中存在對應的鹽離子和金屬離子，適當減少反應緩沖液的用量以保證最終反應體系中的環(huán)境適宜限制性內切酶發(fā)揮功能。

Q:限制性內切酶簡并性識別位點一定是回文的嗎？

A:大多數(shù)二型限制性內切酶的識別序列是回文的，而且是特定的堿基序列。然而有些限制性內切酶具有簡并性識別位點，也就是說識別位點中有一個或以上的堿基對是非特異的（例如：BsrfI識別5’RCCGGY, R=A/G, Y=C/T）。對于這樣的具有簡并性識別位點的限制性內切酶，只要是符合要求的序列皆能被識別并且被正確地切割（例如5’ ACCGGC, 5’ ACCGGT, 5’ GCCGGC, 和5’ GCCGGT，其中兩個并不是回文的，仍然能被BsrFI識別并且切割）。