【實(shí) 驗(yàn) 原 理】

磷酸鈣沉淀法是基于磷酸鈣-DNA復(fù)合物的一種將DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方法。磷酸鈣有利于促進(jìn)外源DNA與靶細(xì)胞表面的結(jié)合。磷酸鈣-DNA復(fù)合物粘附到細(xì)胞膜并通過(guò)胞飲作用進(jìn)入靶細(xì)胞，被轉(zhuǎn)染的DNA可以在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，也可整合到靶細(xì)胞的染色體上從而產(chǎn)生不同基因型和表型的穩(wěn)定克隆。該方法可廣泛用于轉(zhuǎn)染許多不同類型的細(xì)胞。

【儀器、材料和試劑】

（一）儀器、用具

CO2培養(yǎng)箱^[1]、10cm細(xì)胞培養(yǎng)平板、巴斯德吸管、微量移液器^[2]、15ml錐形管、燒杯、量筒等。

（二）材料

呈指數(shù)生長(zhǎng)的真核細(xì)胞BALB/c 3T3

CsCl純化的表達(dá)質(zhì)粒DNA

（三）試劑

1．培養(yǎng)基

DMEM 90ml

FCS 10ml

2．2M CaCl2，過(guò)濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆?/p>

3．2×HEBS (g/500ml)

NaCl 8.0

KCl 0.38

Na2HPO4.7H2O 0.19

HEPES 5.0

葡萄糖 1.0

用NaOH調(diào)pH至6.95，過(guò)濾除菌后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

【方法與步驟】

1．在10cm的培養(yǎng)板上接種1×106個(gè)BALB/c 3T3細(xì)胞

第二天進(jìn)行轉(zhuǎn)染

2．準(zhǔn)備CaPO4沉淀

2.1 準(zhǔn)備兩組試管

在A管中加入： 15μg質(zhì)粒DNA

69μl 2M CaCl2

460μl重蒸水

在B管中加入： 550μl 2×HEBS

2.2 用巴斯德吸管將A管中的溶液緩慢地逐滴加入在B管中，同時(shí)用另一吸管吹打B管溶液，整個(gè)過(guò)程需緩慢進(jìn)行，至少需持續(xù)1～2min。

2.3室溫靜置30min，出現(xiàn)細(xì)小顆粒沉淀。

3. 小心地將沉淀逐滴均勻地加入培養(yǎng)細(xì)胞的10cm平板中，輕輕晃動(dòng)（此過(guò)程需盡快完成）。

4. 在5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞2-6 hr。

5. 除去培養(yǎng)液，加入10ml培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞1-6天（依具體情況而定）。

6. 收集細(xì)胞進(jìn)行基因活性的檢測(cè)，或分散接種到其他培養(yǎng)皿中進(jìn)行選擇培養(yǎng)。

【注 意 事 項(xiàng)】

1．在整個(gè)轉(zhuǎn)染過(guò)程中要保持無(wú)菌操作。

2．在實(shí)驗(yàn)中使用的各種試劑都必須小心校準(zhǔn)，保證質(zhì)量。

3．質(zhì)粒DNA 需CsCl純化，乙醇沉淀后的DNA應(yīng)保持無(wú)菌，在無(wú)菌水或Tris- EDTA中溶解。

4．沉淀物的大小和質(zhì)量對(duì)于磷酸鈣轉(zhuǎn)染的成功至關(guān)重要。在磷酸鹽溶液中加入DNA-CaCl2溶液時(shí)需用空氣吹打，以確保形成盡可能細(xì)小的沉淀物，因?yàn)槌蓤F(tuán)的DNA不能有效地黏附和進(jìn)入細(xì)胞。

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