重組克隆的篩選與鑒定

一、實驗?zāi)康?/span>

通過篩選，獲得含目的片段的重組克隆。掌握利用酶切或PCR方法進(jìn)行陽性克隆的篩選與鑒定步驟。

二、實驗原理

藍(lán)白斑篩選是重組子篩選的一種方法，根據(jù)載體的遺傳特征篩選重組子，如α-互補(bǔ)、抗生素基因等。現(xiàn)在使用的許多載體都帶有一個大腸桿菌的DNA的短區(qū)段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和前146個氨基酸的編碼信息。在這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點（MCS），它并不破壞讀框，但可使少數(shù)幾個氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能，這種載體適用于可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細(xì)胞。因此，宿主和質(zhì)粒編碼的片段雖都沒有酶活性，但它們同時存在時，可形成具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)。這樣，lacZ基因在缺少近操縱基因區(qū)段的宿主細(xì)胞與帶有完整近操縱基因區(qū)段的質(zhì)粒之間實現(xiàn)了互補(bǔ)，稱為α-互補(bǔ)。由α-互補(bǔ)而產(chǎn)生的LacZ+細(xì)菌在誘導(dǎo)劑IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在時產(chǎn)生藍(lán)色菌落，因而易于識別。然而，當(dāng)外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點后，幾乎不可避免地導(dǎo)致無α-互補(bǔ)能力的氨基端片段，使得帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，又稱為藍(lán)白斑篩選。如用藍(lán)白斑篩選則經(jīng)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的鈣化菌平板37℃溫箱倒置培養(yǎng)12-16hr后，有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。 

由于pUC質(zhì)粒帶有氨芐青霉素抗性基因(Amp^r)，可通過Amp抗性來篩選轉(zhuǎn)化子。受體細(xì)胞沒有轉(zhuǎn)入pUC，則在含Amp的培養(yǎng)基上不能生長。能在Amp培養(yǎng)基上生長的受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)化子）肯定已導(dǎo)入了pUC。轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增后，可將轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒提取出，進(jìn)行酶切或PCR等進(jìn)一步鑒定。                   

三、主要試劑

胰蛋白胨、酵母粉、瓊脂、Amp、IPTG、X-Gal

四、儀器耗材

超凈工作臺、培養(yǎng)箱、平皿、移液器、tip。

五、實驗步驟   

1. 記錄樣品的轉(zhuǎn)化子總數(shù)，白色和藍(lán)色菌落各有多少。

2. 記錄對照2的菌落數(shù)，計算陽性對照的轉(zhuǎn)化頻率。

3. 挑取一個白色菌落，接于2mL的LB中

4. 37℃培養(yǎng)過夜。

5. 快速堿裂解法抽提質(zhì)粒，具體方法參見同實驗二。

6. 酶切，同時以提取的質(zhì)粒作對照，具體方法參見實驗三。

取2μL質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切體系如下：10×bf 2μL，限制酶各0.5μL，H₂O 15μL。37度，2-4hr。0.8-1%瓊脂糖電泳檢測。

    7. 或者使用PCR鑒定陽性克隆，具體方法參見實驗一。

六、注意事項

1. IPTG和X-Gal在培養(yǎng)基上一定要涂勻。

2. 平板如在培養(yǎng)后放于冰箱3-4小時可使顯色反應(yīng)充分，藍(lán)色菌落明顯。 

思考題：

1. 如果一個DNA 酶解液在電泳后發(fā)現(xiàn)DNA 未被切動，你認(rèn)為可能是什么原因？

2. 請分析實驗結(jié)果出現(xiàn)假陽性的具體原因。

3. 實驗結(jié)果與分析：如果電泳后（1）只有載體條帶，看不到插入片段的條帶？（2）出現(xiàn)2條以上的條帶？如何解釋。

4. 本實驗的目的是克隆基因Xbc，為基因表達(dá)做準(zhǔn)備。你認(rèn)為經(jīng)過酶切鑒定是否獲得了Xbc的陽性克隆？為什么？并寫出后續(xù)的實驗步驟或計劃。

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