銨產(chǎn)量過多、乳酸產(chǎn)量過剩、營(yíng)養(yǎng)限制或與營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)給、添加堿以控制 pH 值相關(guān)的高滲應(yīng)激等因素，使得動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器中的細(xì)胞密度被限制。

為了部分克服這些因素，使用乳酸補(bǔ)充和適應(yīng)LSA 技術(shù)是減少銨和乳酸產(chǎn)生的一種簡(jiǎn)單方法。使用這種簡(jiǎn)單的方法，可以實(shí)現(xiàn)了將近乳酸產(chǎn)量的大幅度減少，同時(shí)在分批搖瓶培養(yǎng)中減少了 50% 的銨產(chǎn)量。在隨后的補(bǔ)料分批生物反應(yīng)器培養(yǎng)中，使用Biosen C-Line 乳酸分析儀測(cè)定乳酸產(chǎn)量減少了近8八倍。甚至可以實(shí)現(xiàn) 3500 萬個(gè)細(xì)胞/mL 的活細(xì)胞密度和 2.73 億個(gè)細(xì)胞-天/mL 的完整活細(xì)胞天數(shù)。

減少乳酸和銨鹽產(chǎn)量的方法總結(jié)

在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，許多研究人員觀察到乳酸和銨積累會(huì)嚴(yán)重影響到 細(xì)胞的生長(zhǎng)。 60多年來，科學(xué)家已開發(fā)出多種方法來減少乳酸 和銨的產(chǎn)生。

 常用方法匯總見表

        大約在過去 35 年里，隨著生物制藥行業(yè)生物反應(yīng)器動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)從低密度分批培養(yǎng)轉(zhuǎn)向高密度補(bǔ)料分批培養(yǎng)，乳酸和銨積累方面 的挑戰(zhàn)大幅增加。減少乳酸積累制造創(chuàng)新藥物的基本要求是：

(1)在所有與工業(yè)相關(guān)的細(xì)胞系和工藝生產(chǎn)過程中，將乳酸和銨的產(chǎn)量降低到足夠低的水平，以免對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面影響，

(2)在根據(jù)當(dāng)前良好生產(chǎn)規(guī)范 (cGMP) 運(yùn)行的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中。

  為減少乳酸積累曾經(jīng)嘗試過用替代糖替代葡萄糖，當(dāng)時(shí)，人們并未廣泛認(rèn)識(shí)到銨積累可能是一個(gè)問題，因此未報(bào)告有關(guān)銨水平的數(shù)據(jù)(NR)。事實(shí)上，許多早期這樣的方法以及許多目前的方法都減少了乳酸的產(chǎn)生，但增加了銨的產(chǎn)生。當(dāng)測(cè)試用于補(bǔ)料分批培養(yǎng)時(shí)，替代糖（例如半乳糖）有時(shí)會(huì)導(dǎo)致與葡萄糖類似的生長(zhǎng)。

   相對(duì)低水平的銨，通常在 2到10 mM 之間，可能對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和生產(chǎn)力以及糖基化產(chǎn)生負(fù)面影響，甚至可能對(duì)某些重組糖蛋白的生物活性、穩(wěn)定性和/或免疫原性產(chǎn)生負(fù)面影響。銨是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中重要的抑制性代謝物之一。銨的負(fù)面影響通常在比乳酸（例如 20–40 mM）低大約十倍（例如 2–4 mM）的濃度下實(shí)現(xiàn) 。因此，以氨的少量增加為代價(jià)來減少乳酸當(dāng)然是不可取的。

        將培養(yǎng)基中的葡萄糖控制在低水平——以限制葡萄糖對(duì)細(xì)胞的供應(yīng)——已被用于減少乳酸產(chǎn)生超過三十年。這可以通過多種方式實(shí)現(xiàn)，例如直接測(cè)量和自動(dòng)或手動(dòng)反饋控制葡萄糖水平。當(dāng)葡萄糖而非谷氨酰胺被控制在低水平時(shí)，通常會(huì)發(fā)生葡萄糖攝取和乳酸生成的理想減少，但這通常與谷氨酰胺攝取和銨生成的不良增加密切相關(guān). 因此，為了盡量減少乳酸和銨的產(chǎn)生，可能需要同時(shí)控制葡萄糖和谷氨酰胺。

 關(guān)于生物反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)過程中的葡萄糖乳酸含量的測(cè)定可以使用Biosen C-Line 乳酸分析儀，該儀器使用外部傳感器系統(tǒng)對(duì)葡萄糖和乳酸水平進(jìn)行樣品測(cè)試，根據(jù)反應(yīng)罐內(nèi)的養(yǎng)分消耗和細(xì)胞代謝狀態(tài)來適當(dāng)進(jìn)行補(bǔ)料。

 目前，許多研究人員還嘗試開發(fā)代謝工程方法來減少乳酸或銨的產(chǎn)生。總的來說，事實(shí)證明，通過基因工程改善代謝表型比 1980 年代最初設(shè)想的要困難得多。所以，除了 GS 方法之外，迄今為止，還沒有其他減少乳酸 或氨產(chǎn)量的代謝工程方法在工業(yè)中得到廣泛采用。

其實(shí)，當(dāng)前有四種簡(jiǎn)單而常用的減少乳酸和銨產(chǎn)量的方法：

(1) 降低培養(yǎng)溫度

(2) 降低培養(yǎng) pH

         (3) 向培養(yǎng)基補(bǔ)充銅

         (4) 選擇具有乳酸消耗 (LC) 表型的克隆。

         盡管所有這些方法都被普遍采用，但需要注意的是，這些方法均不能普遍減少乳酸和氨的產(chǎn)生。溫度和 pH 變化通常根據(jù)具體情況進(jìn)行優(yōu)化，可能對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和/或產(chǎn)品質(zhì)量 產(chǎn)生負(fù)面 或正面 影響。雖然 pH 值下降通常會(huì)減少乳酸產(chǎn)量 ， 但它也會(huì)導(dǎo)致谷氨酰胺 消耗和銨產(chǎn)量增加 。銅補(bǔ)充劑是一種簡(jiǎn)單的方法，但不會(huì)減少所有相關(guān)細(xì)胞系的乳酸產(chǎn)量，并且還會(huì)對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)生積極或消極的影響。 選擇具有乳酸消耗 (LC) 表型的克隆本質(zhì)上并不普遍，因?yàn)樗枰哂刑囟ㄉa(chǎn)力、產(chǎn)品質(zhì)量或其他潛力的克隆可能會(huì)由于缺乏 LC 表型而被丟棄。對(duì)于某些克隆，LC 表型可能由于未知因素偶爾會(huì)丟失，即使在經(jīng)過驗(yàn)證的 cGMP 工藝生產(chǎn)商業(yè)產(chǎn)品中也是如此。

   LSA 技術(shù) 減少工業(yè)細(xì)胞培養(yǎng)中乳酸和銨產(chǎn)量

     近年來，一種減少生物反應(yīng)器動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中乳酸和銨產(chǎn)量的新方法被提出。這種方法就是LSA 技術(shù)，它主要采用乳酸補(bǔ)充培養(yǎng)基等方式來實(shí)現(xiàn)。使用該技術(shù)，補(bǔ)料分批培養(yǎng)物可生長(zhǎng)至每毫升 3500 萬個(gè)細(xì)胞的活細(xì)胞密度。這個(gè)數(shù)據(jù)遠(yuǎn)高于行業(yè)所公布 的每毫升5-45 百萬個(gè)細(xì)胞的值。同樣，實(shí)現(xiàn)的每毫升 2.73 億個(gè)細(xì)胞日的 IVCD 值也與行業(yè)所公布的每毫升30-2.75 億個(gè)細(xì)胞日的值相當(dāng)。

LSA 技術(shù)作為一項(xiàng)新興起的技術(shù)在細(xì)胞培養(yǎng)行業(yè)尤其是大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)行業(yè)、生物制藥行業(yè)發(fā)揮著重要作用。

     蘇州阿爾法提供的EKF Biosen C-Line 乳酸分析儀可用于生物反應(yīng)器動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中生物反應(yīng)器內(nèi)的葡萄糖、乳酸測(cè)定，同時(shí)支持定制各種規(guī)格的生物反應(yīng)器、生物發(fā)酵罐等，更多實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備需求可進(jìn)入蘇州阿爾法生物實(shí)驗(yàn)器材網(wǎng)站進(jìn)行了解。