使用細胞轉染構建穩定細胞系的方法

細胞系的穩定對于其廣泛應用具有重要作用。經過細胞轉染后的穩定細胞系適用于重組蛋白的生產、基因功能研究以及藥物發現分析。目的基因在細胞系中穩定表達，克服了瞬時表達轉染效率低的問題，產生更多的目的蛋白。
 實現細胞系的穩定主要有兩種途徑：一種是通過真核載體實現，該載體在轉染細胞的細胞核中含有用于附加體維持的元件。另一種是通過將轉染的質粒直接整合到靶細胞基因組中來實現。由于附加型的穩定性比較有限，附加型質粒元件通常僅限于某些物種，因此通常使用整合到宿主細胞染色體中。這種方法所預期的基因修飾的穩定性通常要高得多。
產生穩定細胞系的主要挑戰是低轉染效率和整合頻率。使用的轉染方法可能直接影響到細胞的穩定的表達。我們知道脂質體轉染法中的脂質體試劑可用于將 DNA 轉移到貼壁細胞系中。而電轉染法主要用于難以轉染的懸浮細胞系中。但是電轉染法會受到一些限制，例如載體生產效率和安全問題，而而且電轉染法的細胞存活率較低
選擇標記
   為了選擇穩定轉染的細胞，選擇標記必須與靶蛋白共表達。標記基因可以在同一個質粒載體或第二個共轉染載體上。有多種系統用于選擇轉染細胞，包括對抗生素嘌呤霉素、新霉素、DHFR 和谷氨酰胺合成酶的抗性。基因轉移后，細胞在含有選擇劑的培養基中進行培養。只有那些含有耐藥基因的細胞才能存活。
產生穩定細胞系的方法
根據實驗的范圍，有幾個選項可用于生成穩定的細胞系。耐藥細胞的混合群體可以直接用于實驗分析，其特點是快速產生結果，但也有處理不確定和遺傳混合細胞群體的缺點。還有一種辦法是生成單克隆細胞系。在這種方法中，需要通過在 96 孔板中鋪板來稀釋抗性細胞，以便培養為單個和分離的細胞。隨后，可以重復多次克隆單細胞以獲得全部的克隆純度。總之，根據目的表達類型和您要整合的構建體，可以有許多不同的方法來生成穩定的細胞系。
穩定細胞系的形成條件
   所選細胞類型的培養條件（傳代、分裂節律、數量等）對于穩定細胞系的產生尤為重要。正常情況下，為了促進良好的增殖和細胞生理，細胞系應在實驗前兩天進行傳代。此外，細胞通道不應高于30，因為可能會干擾集成效率。
實驗步驟如下：
1.選擇G418濃度
   由于不同細胞系之間對于 G418反應是不同的，許多細胞系會隨細胞傳代次數而發生變化。這個時候就需要通過實驗確定特定細胞類型的選擇條件（例如 G418 濃度、鋪板密度）。確定低水平的 G418 濃度，從而減少對細胞的生長的影響。需要注意的是庫存 G418 的活性濃度也可能因批次而異。因此，我們建議對每個新批次測試 G418 靈敏度。具體方法如下：

l 在板的每個孔中預板 100 μl 培養基。
l 在第一列 (#1) 中加入 100 μl 每孔含有 4000 個細胞的細胞懸液。
l 輕輕上下移液后，將 100 μl 移至下一列，從而以 1:2 的比例稀釋。對每個連續的列重復此過程。
l 完成后從末列 (#12) 丟棄 100 μl。第一列每孔應包含約 2000 個細胞，末列平均每孔包含約一個細胞。
l 將 100 μl 含有 G418 的培養基 (2.8 mg/ml) 添加到第一行 (A)，使 G418 的終濃度為 1.4 mg/ml。
l 將 G418 添加到以下行中，以逐步降低 G418 的濃度至 0.2 mg/ml。末行 (H) 添加不帶 G418 的培養基。
l 在標準條件下孵育細胞。
l 通過顯微鏡分析細胞生長。在某些情況下，細胞生長也可以通過培養基顏色的變化來觀察。
l 如果您在沒有 G418 的孔中觀察到細胞生長（10 天后），可以合理地假設這些細胞可以從單個細胞開始生長。
l 選擇略高于顯示全細胞死亡的 G418 濃度作為適當的 G418 濃度進行選擇。
2. 細胞轉染
對于轉染，可以使用轉染試劑盒將含有靶基因和耐藥基因序列的表達質粒直接轉染細胞中。這個過程中盡量設置未轉染細胞的陰性對照組以進行選擇。可同時用 GFP 對照質粒來檢查實驗的轉染效率和整合頻率。
3. 轉染后的細胞選擇
轉染后，讓細胞生長并在非選擇性條件下表達 G418 抗性蛋白約 24-48 小時（根據您的轉染系統達到蛋白表達峰值）。
直接使用懸浮細胞或用胰蛋白酶消化貼壁細胞進行分析。在轉染后 24-48 小時通過顯微鏡或蛋白質印跡分析您的靶蛋白和陽性對照，分析轉染效率。
通過臺盼藍染色或其他適當的方法計數活細胞。
使用針對細胞類型預先測試過的標準培養基和適量的 G418，將細胞置于 96 孔板中，每孔具有不同的細胞數（例如，0.5、1、2、5、10），體積至少為 100 μl每孔。根據之前確定的細胞濃度，連續稀釋。在播種前懸浮細胞很重要，但要避免通過頻繁移液進行苛刻的處理。
一旦出現未轉染的對照孔中的細胞全死亡，就可以分析或進一步擴增細胞克隆。
4. 穩定細胞系的分析
一旦獲得抗性細胞系，應該擴增細胞并與陽性和陰性對照比較靶基因。穩定細胞系的分析主要包括蛋白質印跡、顯微鏡檢查、ELISA，以及流式細胞術等方式來檢測融合蛋白的表達。
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