Western Blot實(shí)驗(yàn)步驟

更新時(shí)間：2022-03-31

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本文摘要
蛋白質(zhì)印跡技術(shù)（免疫印跡實(shí)驗(yàn)）又稱為Western Blot。它是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法。Western Blot主要用于檢測(cè)或分析蛋白，應(yīng)用領(lǐng)域集中在基因表達(dá)研究、抗體活性檢測(cè)和疾病診斷等。
01 蛋白質(zhì)印跡基本流程圖

02 western blot步驟
樣品準(zhǔn)備：

Tanon 連續(xù)梯度預(yù)制膠（4-20% 10 孔/15 孔/17 孔）；（4-12% 10 孔/15 孔/17 孔）
Tanon Mops/MES 電泳緩沖液（粉劑）
Tanon 預(yù)染蛋白 Marker
Tanon 4×LDS Loading Buffer
Tanon 快速蛋白染液
預(yù)制膠規(guī)格的選擇

在不使用預(yù)制膠的情況下，需要自行配置適合蛋白電泳SDS膠，采取自制膠的方法從加入緩沖液到制膠完成這一過程大概需要花費(fèi)將近1個(gè)小時(shí)。并且由于配比過程中的認(rèn)為誤差容易產(chǎn)生濃度不均一，穩(wěn)定性差，已出現(xiàn)外八型、笑臉型等條帶。采用天能系列預(yù)制膠具有較高的穩(wěn)定性和均一性，使蛋白電泳條帶更清晰銳利，使得條帶更加均勻。還有重要的一點(diǎn)就是可以免去制膠的時(shí)間，大大提升了實(shí)驗(yàn)效率。
蛋白轉(zhuǎn)印使用天能VE-586轉(zhuǎn)移電泳槽主要優(yōu)勢(shì)在于:它可以在不埋冰的情況完成的蛋白電泳，如果配合快速轉(zhuǎn)膜液，整個(gè)電泳過程只需不到30分鐘，可同時(shí)轉(zhuǎn)印4塊膠，操作方法也比較簡(jiǎn)便。在縮短轉(zhuǎn)印時(shí)間的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)了蛋白樣品的高效轉(zhuǎn)印。

蛋白電泳
目前常用的是SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳），蛋白質(zhì)會(huì)根據(jù)分子量大小分開，分子量的蛋白會(huì)留在膠的下部，分子量大的會(huì)在膠的頂部。

04轉(zhuǎn)膜
轉(zhuǎn)膜主要是將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上，常用的是NC膜和PVDF（聚偏氟乙烯），由于膜與蛋白質(zhì)高度親和的能力，所以更容易與蛋白結(jié)合。為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果，可以使用蛋白預(yù)染Marker，以方便判斷蛋白分子量大小。
蛋白預(yù)染的傳統(tǒng)方法是膜將置于脫色搖床上，用1×麗春紅染液振蕩預(yù)染5min。然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。
蛋白轉(zhuǎn)印使用天能VE-586轉(zhuǎn)移電泳槽主要優(yōu)勢(shì)在于:它可以在不埋冰的情況完成的蛋白電泳，如果配合快速轉(zhuǎn)膜液，整個(gè)電泳過程只需不到30分鐘，可同時(shí)轉(zhuǎn)印4塊膠，操作方法也比較簡(jiǎn)便。在縮短轉(zhuǎn)印時(shí)間的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)了蛋白樣品的高效轉(zhuǎn)印。

05封閉
轉(zhuǎn)印完成后，為阻止抗體的非特異性結(jié)合，需要用脫脂牛奶或者牛血清蛋白（BSA）作為緩沖液來(lái)填充封閉空白結(jié)合位點(diǎn)。
加入二抗稀釋液（一般1:1000甚至1:10000用TBST稀釋），放在搖床上，室溫下孵育1h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10min；再用TBS洗一次，10min，即可進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。
注意：二抗孵育之后也要注意充分洗滌，一般30min左右為宜，如果洗膜不夠充分，顯影時(shí)會(huì)造成雜色背景。

06 ECL化學(xué)發(fā)光反應(yīng)：
在工作臺(tái)上鋪一張保鮮膜，將PVDF膜置于保鮮膜上。將ECL的A和B兩種試劑在EP管內(nèi)等體積混合（注意吸完A試劑后吸B試劑前要更換槍頭），然后均勻滴在PVDF膜的蛋白面，反應(yīng)1~2min后，將PVDF膜上多余的ECL發(fā)光液吸干，進(jìn)行固定。

07凝膠圖象分析
將膠片進(jìn)行掃描或拍照，使用凝膠成像儀進(jìn)行成像分析。常用的凝膠成像儀有天能系列的T4600，T5200等系列。